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? ? ?中國倉鼠卵巢(CHO)細胞,已成為治療用蛋白類(lèi)生物制品生產(chǎn)的主要細胞類(lèi)型。隨著(zhù)瞬時(shí)轉染技術(shù)(transient transfection)的進(jìn)步,搭配CHO細胞進(jìn)行毫克至克級別蛋白的快速、高效生產(chǎn),幫助推動(dòng)藥物研發(fā)階段進(jìn)程,允許更早的評估候選藥物是否具備理想屬性,從而投入更多資源生成穩定的克隆細胞系,用于后續藥物的臨床開(kāi)發(fā)。
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? ? ? ?憑借20年在核酸遞轉領(lǐng)域的深耕細作,Mirus推出了用于CHO細胞蛋白/抗體生產(chǎn)的完整瞬轉系統——CHOgro? High Yield Expression System。通過(guò)整合Mirus獨有的專(zhuān)利轉染技術(shù)及優(yōu)化的CHO培養基,相比于現有技術(shù)方案,可將蛋白表達量提升2-10倍。除此之外,該系統不含動(dòng)物源性成分,致力于穩定的提高懸浮CHO細胞的蛋白質(zhì)產(chǎn)量。本文首先就影響CHO細胞在蛋白表達實(shí)驗中的關(guān)鍵影響因素進(jìn)行討論,包括轉染試劑、培養基選擇、增強子使用及培養溫度優(yōu)化;Mirus CHOgro? High Yield Expression System體系,綜合考慮上述影響CHO蛋白表達的關(guān)鍵因素,并且將轉染試劑、培養基及增強子進(jìn)行優(yōu)化、整合;最后,結合Mirus CHOgro? High Yield Expression System針對不同蛋白/抗體類(lèi)型的表達產(chǎn)量、體系放大以及細胞類(lèi)型適配性數據,充分證明了Mirus CHOgro? High Yield Expression System具備高產(chǎn)量、高穩定性、廣泛的適配性以及操作靈活性等優(yōu)勢。
Mirus CHOgro? High Yield Expression System(產(chǎn)品貨號:MIR 6270)中包括了以下組分:
產(chǎn)品名稱(chēng) |
規格 |
單組分貨號 |
TransIT-PRO? 轉染試劑 |
1 x 1 mL |
MIR 5740 |
CHOgro? Titer Enhancer |
1 x 20 mL |
MIR 6220 |
CHOgro? Expression Medium |
2 x 1 L |
MIR 6200 |
CHOgro? Complex Formation Solution |
1 x 100 mL |
MIR 6210 |
Poloxamer 188, 10% |
1 x 100 mL |
MIR 6230 |
L-glutamine, 200 mM |
1 x 100 mL |
MIR 6240 |
CHO細胞蛋白表達關(guān)鍵影響因素之轉染試劑
CHOgro? High Yield Expression System系統中關(guān)鍵組分TransIT-PRO?轉染試劑,通過(guò)優(yōu)化瞬時(shí)轉染效率,可進(jìn)一步提高目標蛋白/抗體產(chǎn)量。同樣的,該轉染試劑不含動(dòng)物源成分,可以與懸浮CHO或者293細胞搭配使用,并且可以兼容不同種類(lèi)的培養基,旨在提高生產(chǎn)蛋白/抗體產(chǎn)量及穩定性。
測試使用CHOgro? High Yield Expression System系統中TransIT-PRO?轉染試劑(試劑:DNA比例為1:1),在CHO-S細胞瞬轉表達GFP熒光蛋白。轉染后48小時(shí),分別使用流式細胞儀和熒光顯微鏡檢測試劑轉染效率和細胞活力。結果表明,單獨使用TransIT-PRO?轉染試劑,可達到高水平的轉染效率(圖1)。
圖1. 單獨使用Mirus CHOgro? High Yield Expression系統中的轉染試劑(TransIT-PRO? 轉染試劑),也有著(zhù)高水平的轉染效率。
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CHO細胞蛋白表達實(shí)驗關(guān)鍵影響因素之培養基
CHOgro? High Yield Expression System中的另一關(guān)鍵組分CHOgro? Expression Medium,也是提升CHO細胞蛋白/抗體表達量的重要因素。細胞的生長(cháng)狀態(tài)、是否結團、細胞密度等都是評估CHO細胞培養基的關(guān)鍵參數。
在細胞生長(cháng)狀態(tài)方面,轉染FreeStyle? CHO-S細胞后,分別在CHOgro? Expression Medium和其他品牌培養基中進(jìn)行培養。轉染后六天,用CHOgro? High Yield Expression System中的CHOgro? Expression Medium培養的細胞結團數量明顯少于其他品牌培養基(圖2)。
圖2. 使用Mirus CHOgro? High Yield Expression System中的CHOgro? Expression Medium進(jìn)行培養(左),細胞結塊數量顯著(zhù)少于其他培養基培養的CHO-S細胞(右)。
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同樣的,使用相同細胞系(FreeStyle? CHO-S)及細胞密度(0.5×106 cells/ml),平行比較Mirus CHOgro? Expression培養基及其他品牌培養基。實(shí)驗結果顯示,在Mirus CHOgro? Expression培養基中生長(cháng)的細胞,有著(zhù)更高的細胞密度,這也是提高CHO細胞蛋白/抗體產(chǎn)量的重要前提。并且,在更高的細胞密度條件下,仍保持較高的細胞活性(圖3)。
圖3. 使用CHOgro? Expression Medium培養,CHO細胞密度更高,并且保持著(zhù)較高細胞活性。
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CHO細胞蛋白表達實(shí)驗關(guān)鍵影響因素之增強子
使Mirus研發(fā)團隊針對不同應用或者細胞類(lèi)型,開(kāi)發(fā)出多種相適配增強子,例如針對CHO細胞蛋白/抗體生產(chǎn)的增強子CHOgro? Titer Enhancer,也是包含在CHOgro? High Yield Expression System中的一個(gè)關(guān)鍵組分。其作用機制并非直接增加細胞的轉染效率,而是通過(guò)調節細胞內特定的信號通路來(lái)增加CHO細胞的蛋白表達滴度。平行實(shí)驗分別對比了CHO細胞對Fc融合蛋白與IgG的表達量,結果表明,與單獨使用TransIT-PRO? 轉染試劑相比,加入CHOgro? Titer Enhancer后,CHO細胞Fc融合蛋白的產(chǎn)量有顯著(zhù)提升(圖4)。此外,與PEI轉染體系相比,使用CHOgro系統的轉染試劑和增強子,CHO細胞IgG的表達量可提高約3倍(圖5)。
圖4. 加入CHOgro? Titer Enhancer后,CHO細胞Fc融合蛋白的產(chǎn)量有顯著(zhù)提升
圖5. TransIT -PRO?轉染試劑搭配CHOgro? Titer Enhancer,相較于PEI轉染體系,CHO細胞IgG的表達量可提高約3倍
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CHO細胞蛋白表達實(shí)驗關(guān)鍵影響因素之培養溫度
Mirus CHOgro? High Yield Expression System除了通過(guò)培養基、轉染試劑以及增強子三者的優(yōu)化結合,在實(shí)驗流程上也可以進(jìn)行優(yōu)化,從而進(jìn)一步提高蛋白產(chǎn)量。根據科研或者不同應用需求,Mirus CHOgro? High Yield Expression System有著(zhù)多種靈活實(shí)驗方案供選擇:
方案一:Mirus CHOgro? High Yield Expression System實(shí)驗方案中所推薦的標準流程,即在轉染當天加入CHOgro? Titer Enhancer,并立刻將細胞培養溫度從37℃轉移至32℃,轉染后7-8天內收獲蛋白,細胞活性仍可保持70%以上;
方案二:在方案一的基礎上通過(guò)添加補料來(lái)延長(cháng)細胞培養時(shí)間,保證細胞更長(cháng)時(shí)間維持較高的密度和活率,將蛋白收獲時(shí)間延長(cháng)至7-11天;
方案三:轉染后的細胞仍維持在37℃條件下培養,不加入補料,并在最短時(shí)間(4-5天)收獲蛋白;
方案四:轉染后的細胞仍維持在37℃條件下培養,通過(guò)在轉染后18-24小時(shí)添加補料維持細胞密度和活率,將蛋白收獲時(shí)間延長(cháng)至4-7天。(有關(guān)添加細胞培養補料以維持細胞活率的建議,請參閱完整版實(shí)驗方案)(圖6)。
圖6. CHOgro? High Yield Expression System的多種細胞培養方案
基于以上四種實(shí)驗方案,分別測試了在轉染后32℃和37℃培養條件下,以及是否添加補料對CHO細胞IgG產(chǎn)量的影響。實(shí)驗使用CHOgro? High Yield Expression System,加入轉染復合物及CHOgro? Titer Enhancer后,立即將CHO細胞轉移至32℃(左)或保持在37℃(右)。結果顯示,轉染后將細胞轉移到32℃條件下培養,IgG產(chǎn)量更高且細胞存活時(shí)間更長(cháng)(圖7)。
圖7. 轉染后將細胞轉移到32℃條件下培養,IgG產(chǎn)量更高且細胞存活時(shí)間更長(cháng)
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盡管Mirus CHOgro? High Yield Expression System從CHO細胞蛋白表達實(shí)驗關(guān)鍵組分即轉染試劑、培養基和增強子進(jìn)行了優(yōu)化整合,并提供了靈活的實(shí)驗應用方案來(lái)提升CHO細胞的蛋白產(chǎn)量,那么在實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中,該系統針對不同類(lèi)型蛋白/抗體的產(chǎn)量、體系放大以及細胞類(lèi)型適配性如何呢?
Mirus CHOgro? High Yield Expression System針對不同類(lèi)型蛋白/抗體的表達,有著(zhù)更高產(chǎn)量
使用相同的細胞類(lèi)型(FreeStyle? CHO-S cells)和質(zhì)粒骨架,分別表達六種不同的治療性抗體,比較測試了Mirus CHOgro? High Yield Expression System和其他品牌表達系統。實(shí)驗結果表明,在所有測試的六種抗體類(lèi)型中,使用Mirus CHOgro? High Yield Expression System的CHO細胞表達的蛋白滴度更高,并且轉染試劑用量更少,蛋白生產(chǎn)成本更低(圖8)。
圖8. 相比其他品牌CHO轉染表達系統,Mirus CHOgro? High Yield Expression System有著(zhù)更高的蛋白產(chǎn)量
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CHOgro? High Yield Expression System生產(chǎn)規模的可擴展性
通過(guò)對6孔板(細胞培養體積2mL)至5L搖瓶(細胞培養體積2L)等不同培養體積進(jìn)行轉染,對CHOgro? High Yield Expression System生產(chǎn)規模的可擴展性進(jìn)行評估,實(shí)驗結果表明,從最小反應體系(6孔板)至最大反應體系(5L搖瓶),生產(chǎn)體系放大了1000倍,都有著(zhù)近似的蛋白滴度,意味著(zhù)CHOgro? High Yield Expression System可以整合到不同CHO細胞蛋白/抗體研究和生產(chǎn)工作流中(圖9)。
圖9. Mirus CHOgro? High Yield Expression System的生產(chǎn)體系擴大1000倍,依然保持著(zhù)近似的蛋白產(chǎn)量。
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CHOgro? High Yield Expression System不同CHO細胞適配性
選擇兩種常用于蛋白/抗體生產(chǎn)的CHO懸浮細胞CHO-S和ExpiCHOTM,評估CHOgro? High Yield Expression System對不同CHO細胞類(lèi)型的適配性。實(shí)驗結果表明,CHOgro? High Yield Expression System可適配多種CHO細胞類(lèi)型,在不同CHO細胞中的蛋白表達也有著(zhù)近似的產(chǎn)量(圖10)。
圖10. Mirus CHOgro? High Yield Expression System可適配不同CHO細胞類(lèi)型
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綜合上述,通過(guò)上述Mirus CHOgro? High Yield Expression System的測評數據,表明了該系統具有以下特點(diǎn)及優(yōu)勢:
- 更高的蛋白產(chǎn)量:可將CHO細胞瞬轉的蛋白表達量提升2-10倍
- 可穩定放大生產(chǎn)體系:將轉染體系放大1000倍,其蛋白表達量依然保持穩定
- 適配不同類(lèi)型CHO細胞:搭配不同類(lèi)型CHO細胞也可得到近似蛋白產(chǎn)量
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如何查找或選擇適合的轉染試劑?
? ? 請登錄Mirus官網(wǎng)線(xiàn)上工具Reagent Agent?,支持超過(guò)1000種細胞類(lèi)型、多種核酸類(lèi)型轉染試劑查詢(xún)。
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Mirus產(chǎn)品年鑒
? ? ? ?美國Mirus公司成立于1995年,是世界上很早開(kāi)發(fā)高效、低毒轉染試劑的公司,同時(shí)也是該類(lèi)試劑的主要供應商之一。其產(chǎn)品線(xiàn)涵蓋化學(xué)轉染試劑、電轉染產(chǎn)品、病毒生產(chǎn)和轉導產(chǎn)品,適用于基因功能研究、蛋白生產(chǎn)、病毒載體生產(chǎn)和動(dòng)物模型構建等領(lǐng)域。Mirus被公認為轉染試劑開(kāi)發(fā)的領(lǐng)跑者,其許多杰出成果獲得世界公認與廣大用戶(hù)的好評。
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? ? 北京西美杰科技有限公司是Mirus中國區代理,始終秉承著(zhù)專(zhuān)業(yè)、嚴謹的態(tài)度為客戶(hù)提供優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品與服務(wù),Mirus熱銷(xiāo)轉染產(chǎn)品常備現貨。如果您對上述產(chǎn)品感興趣,歡迎致電北京西美杰客服熱線(xiàn)400-050-4006或登錄網(wǎng)站www.zlqzone.cn了解更多產(chǎn)品信息。
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